Статья на конкурс «био/мол/текст»: Более полувека назад учёные усмотрели связь между процессом клеточного дыхания и старением. Сегодня известно как факт, что при окислении органики в клетке выделяются потенциально опасные метаболиты, играющие важную роль в развитии целого ряда заболеваний. Митохондриально адресованные антиоксиданты, также известные как ионы Скулачёва , предоставляют новые возможности в борьбе с такими патологиями, как инфаркт и инсульт. А в 2013 году лаборатория структуры и функций митохондрии под руководством Д. Б. Зорова из НИИ ФХБ им. Белозерского показала, что ионы Скулачёва могут помочь и больным острым пиелонефритом.
Главный спонсор конкурса — дальновидная компания
Генотек
.
Конкурс поддержан
ОАО «РВК»
.
Обратите внимание!
Эта работа представлена на конкурс научно-популярных статей «био/мол/текст»-2014 в номинации «Лучшее новостное сообщение».
Спонсором номинации «Биоинформатика» является Институт биоинформатики . Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма Helicon . Свой приз также вручает Фонд поддержки передовых биотехнологий .
Принцип лечения бактериальных инфекций не претерпел никаких изменений со времён открытия пенициллина в первой половине прошлого века: больной использует антибиотики в той или иной лекарственной форме в надежде, что бактерии умрут быстрее, чем у них появится устойчивость к прописанному лекарству. При этом антибиотики могут вызывать у больного ряд побочных эффектов, как например дисбактериоз и проблемы с пищеварением, а некоторым категориям пациентов (дети, беременные женщины, аллергики) антибиотики могут быть вообще противопоказаны.
Здесь уместно провести параллель между борьбой с бактериальной инфекцией и боевыми искусствами. В основу философии айкидо — известного во всём мире японского боевого искусства — положена идея противостояния силе не силой, но мягкостью. Почти любая философия боя предполагает логичным сопротивление силе противника своей собственной агрессией. В айкидо же этот метод ведения боя считается тупиковым: необходимо умерить свой пыл, ведь преумножение агрессии приводит лишь к нарушению гармонии, что, в свою очередь, ведёт к поражению.
Как ни странно, идея удержания собственной агрессии в бою нашла применение и в клеточной биологии, а в частности — в разработке нового подхода к лечению острых инфекционных заболеваний. Этот подход основывается на осуществлении контроля над клеточным дыханием в тканях больного, роль которого при борьбе с инфекцией крайне важна.
Клеточным дыханием называют получение энергии при помощи контролируемого окисления питательных веществ в структурах, называемых митохондриями. Иногда в процессе дыхания кислород по ещё не вполне ясным причинам может образовывать ряд короткоживущих, но крайне активных соединений: супероксид О2·−, гидроксильный радикал ОН·, перекись водорода H2O2. Эти вещества, называемые активными формами кислорода (АФК), будто выжигают клетку изнутри и могут даже приводить к её смерти [1] . В митохондриях существует семь источников АФК, причём два из них устроены так, что образовавшиеся АФК легко покидают место синтеза и, как огонь, перекидываются на другие клеточные структуры [2] . Но даже та часть АФК, что остаётся внутри митохондрии, способна разрушить митохондриальную ДНК и другие части этой органеллы, необходимые для контроля клеточного дыхания.
В 50-х годах прошлого века возникла свободнорадикальная теория старения за авторством Денэма Хармэна . К 1980 году она развилась в митохондриальную теорию старения, согласно которой именно производимые этими структурами АФК и являются причиной дегенеративных возрастных изменений [3] . В наше время, хотя и доказана корреляция между уровнем АФК и возрастом, накопленные данные не позволяют заключить, являются ли они причиной или лишь следствием старения [4] .
Выходит, АФК — это плохо? Не совсем так, даже совсем не так. АФК вовлечены во множество сигнальных путей в клетке [5] , некоторые из которых направлены на повышение устойчивости к стрессовым ситуациям (голодание, гипоксия).
Помимо прочего, перекись, образуемая митохондриями или ферментом NADPH-оксидазой (NOX, NADPH-Oxydase) [6] , применяется иммунными клетками в качестве оружия в борьбе с инфекцией. Такое сознательное производство АФК при бактериальных инфекциях осуществляется подтипом белых кровяных телец — нейтрофилами, — а также макрофагами. Перекись может либо продуцироваться во внутриклеточный резервуар — фагосому, захватившую бактерии, — либо же выделяться в межклеточное пространство — наружу. В любом случае бактерии не выдерживают окислительного стресса, их количество уменьшается, и заражение сходит на нет. По крайней мере так должно быть, но к сожалению, на практике редко встретишь столь идеальный ход событий.
Как уже упоминалось выше, высокие концентрации АФК в состоянии нанести ущерб не только бактериям, но и клеткам больного. Вообще говоря, в митохондриях переплетается множество сигнальных путей, одни из которых ведут к выживанию клетки, а другие — к её апоптозу, смерти. И в этих путях уровень АФК часто играет главную роль. Тут мы как раз и возвращаемся к затронутой в самом начале статьи теме сопротивления силой агрессии. Чрезмерное образование АФК в качестве защитной реакции на инфекцию зачастую нарушает баланс между сигналами жизни и сигналами смерти. Научиться управлять ими — заветная мечта учёных.
В митохондриях энергия, полученная при окислении питательных веществ, используется для создания электрохимической разности потенциалов ионов водорода на внутренней мембране митохондрий. Эта разность потенциалов, или напряжение, впоследствии позволяет митохондриальным ферментам запасать энергию в виде молекул аденозинтрифосфата (АТФ).
Образование АФК клеткой тоже напрямую зависит от электрохимических характеристик митохондрий. Так, снижение напряжения на внутренних мембранах митохондрий всего на 10% снижает образование АФК в десять раз [7] ! Это действительно впечатляющая цифра. Вопрос только один: какое вещество способно накапливаться и снижать генерацию АФК в митохондриях?
В 1970-х годах академик В. П. Скулачёв, ныне декан факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ, показал, что липофильные катионы с высокой селективностью проникают в митохондрии, влекомые разницей потенциалов (внутри митохондрий — отрицательный заряд, а сами катионы заряжены положительно). Сейчас такие вещества с подачи американского биохимика Дэвида Грина в 1974 году называют ионами Скулачёва. При сращивании этих катионов с антиоксидантами можно получить мощное средство в борьбе с окислительным стрессом.
В 2005–2006 годах начался проект по поиску нового типа лекарств на базе ионов Скулачёва, который был оформлен как компания « Митотех ». Первые попытки создать такой биотехнологический препарат были не совсем успешны. Однако уже в 2007 появились многообещающие результаты по отечественным митохондриально-адресованным антиоксидантам (МАА): ионы Скулачёва замедляют развитие возрастных заболеваний, снижают область поражения при инфарктах и инсультах, помогают при лечении некоторых форм рака [8, 9]. Тем не менее годом позже, по причине мирового экономического кризиса, проект лишился своего инвестора — Олега Дерипаски. Но вскоре «Митотех» обрела новых инвесторов: Росток и РОСНАНО. Сейчас исследования продолжаются, и даже создано полноценное лекарство от целого комплекса глазных заболеваний — Визомитин. В планах — создание препарата системного действия и выход на мировой рынок лекарств.
Сейчас одним из самых перспективных веществ данного класса является SkQR1 (см. рис. 1), антиоксидант в котором представлен пластохиноном — переносчиком электронов из хлоропластов растений. Это вещество эффективно снижает электрохимическое напряжение даже в очень маленьких концентрациях. Это явление объясняется тем, что SkQR1 за счёт взаимодействия с белками митохондрий возвращается в исходную форму, готовую принять на себя удар АФК.
В июле 2013 года ведущее американское научное издание Proceedings of National Academy of Sciences опубликовало крайне интересную работу «Защитный эффект митохондриально адресованных антиоксидантов при острой бактериальной инфекции» [10] , в которой описывается результат использования МАА в качестве единственного лекарства при острых бактериальных заболеваниях на примере пиелонефрита. Далее об этой работе, выполненной на базе НИИ ФХБ им. Белозерского, рассказывается более подробно.
Пиелонефрит — воспаление почек и верхних мочепроводящих путей, вызванное размножением в них бактерий. При этом заболевании образуются карманы с гноем, сами почки увеличивается в размерах из-за плохого оттока мочи и крови. Даже после успешного лечения в них остаются множественные рубцы. В худшем случае пиелонефрит может привести к заражению крови и сепсису — распространению заражения по всему организму. Причём острый пиелонефрит развивается стремительно (в течение нескольких дней), именно поэтому так важно быстро его диагностировать и начать лечить.
Традиционно для этих целей применяют антибиотики и противовоспалительные препараты. Однако ни то, ни другое не способно снизить окислительный стресс, с которым сталкиваются ткани больного при выбросе АФК нейтрофилами. Тем более в некоторых случаях антибиотики могут оказаться малоэффективными или быть просто противопоказаны пациенту. МАА — совсем иной класс веществ, на который возлагаются большие надежды.
Возвращаясь к параллели с айкидо, можно сказать, что стратегия «мягкости» — умеренной регуляции окислительного стресса и нормализации воспалительного и антибактериального ответа самого организма — способна в длительной перспективе принести больший успех в борьбе с инфекционными болезнями. Тогда как «сила» — то есть, безудержное наращивание арсенала антибиотиков — всё чаще оборачивается поражением, порождая все больше штаммов устойчивых бактерий и вызывая серьезные побочные явления у пациентов.
Эффективность МАА проверялась по множеству параметров на двух моделях: in vivo (на крысах) и in vitro (букв. «в пробирке»). В первом случае в мочевой пузырь крыс вводилась разведённая на питательной среде культура бактерий, в течение двух суток некоторым подопытным проводилось четыре инъекции SkQR1. К концу определённого срока (два дня или неделя) ткани их почек забирали на анализы. Во втором случае культуру почечных клеток (RTC — Renal Tubular Cells) два дня культивировали вместе с выделенными из крови лейкоцитами на питательной среде, содержащей бактериальный эндотоксин липополисахарид (LPS) или оболочки самих бактерий (эти добавки распознаются иммунными клетками* как живые возбудители и запускают соответствующие реакции). В питательную среду также добавлялись различные МАА.
* — за открытие механизмов распознавания иммунными клетками чужеродных агентов в 2011 была вручена Нобелевская премия по физиологии и медицине [11, 12].
Доказано: активация лейкоцитов приводит к скачку уровня АФК в пять раз и значительному увеличению косвенных показателей окислительного стресса. Однако простое наличие контакта между неактивированными лейкоцитами и RTC тоже приводит к повышению АФК, но в два раза меньше, по сравнению с активированными.
Помимо этого контакт RTC и лейкоцитов приводит к повышению TNFα — белка, провоцирующего апоптоз и являющегося ключевым элементом в процессе воспаления. Чтобы проверить взаимосвязь TNFα и АФК, культуру RTC вырастили в среде, богатой этим белком. Уровень активных форм кислорода повышался прямо пропорционально содержанию TNFα, который выделялся и самими клетками культуры (преимущественно лейкоцитами). Действие TNFα на почку может спровоцировать лавинообразный процесс, при котором выделившиеся АФК создают благоприятные условия для образования новых молекул АФК [13] .
В процессах воспаления кроме TNFα участвуют и многие другие белки, в том числе Bcl-2 и pGSK-3β. Эти белки отвечают за выживаемость клетки и её устойчивость к АФК. Обычно при пиелонефрите содержание этих белков падает, однако МАА в некоторой степени восстанавливают их количество.
Таким образом, МАА — и SkQR1 в частности — при своевременном применении напрямую снижают концентрацию АФК, сдерживают их лавинообразный выброс и обеспечивают преобладание сигналов выживания (см. рис. 3). Всё это достигается лишь восстановлением нормального функционирования митохондрий в RTC и лейкоцитах.
Насколько же эффективен SkQR1 не в далекой от жизни модели in vitro, но при лечении живых крыс? Прежде всего, стоит сказать, что этот препарат, не являясь антибиотиком, понизил уровень патогенных микроорганизмов в моче крыс. Но что гораздо более волнующе: смертность крыс, которым проводили инъекции SkQR1, резко снизилась (рис. 4)!
Подобные результаты заставляют задуматься: митохондрии появились в клетках более миллиарда лет назад и в ходе эволюции должны были превратиться в непогрешимый механизм. Тем не менее, проведённые с МАА исследования указывают на чудовищные неполадки в этом на первый взгляд идеальном элементе клеточной структуры. Неужели учёным удалось исправить ошибки матери-природы, или же их близорукость мешает заметить какую-то помарку в своих расчётах?
Согласно теории симбиогенеза, митохондрии произошли от бактерий, которые стали жить внутри других одноклеточных организмов. Может быть, подобная несогласованность действий — остатки автономии бактериальных предков?
Как бы то ни было, препараты на базе ионов Скулачёва предоставляют надежду, что в скором будущем человечество будет готово противопоставить бактериальным инфекциям и сердечно-сосудистым заболеваниям нечто более эффективное, чем то, что у них есть сейчас.
См. также: