ДНК-вакцины относятся к типу принципиально новых биологических препаратов. С их разработкой связывают большие надежды на повышение эффективности профилактики не только заболеваний бактериальной, вирусной и паразитарной природы, но и аллергических, аутоиммунных и даже онкологических болезней. Более двадцати лет назад возникла идея использовать гены возбудителей заболеваний для активации защитных механизмов. Конструкция ДНК-вакцин гениально проста: главные компоненты в ней — вектор и целевой иммуноген. Но, несмотря на это, ДНК-вакцины не стоят на страже нашего здоровья: их не вводят пациентам в поликлиниках, они не продаются в аптеках...
Эта работа публикуется в рамках конкурса научно-популярных статей , проведенного на конференции «Биология — наука 21 века» в 2015 году.
Более сотни лет прошло с введения Л. Пастером термина «вакцина» (лат. vacca — корова) и более двух сотен — с легендарных экспериментов Э. Дженнера по прививанию коровьей оспы ребенку с целью предупреждения развития опасного человеческого варианта болезни. Принцип защитного действия введенных в организм ослабленных инфекционных агентов или их частей научным языком объяснили уже в XX веке: безопасный чужеродный антиген учит иммунную систему в дальнейшем быстро распознавать и уничтожать активного и опасного возбудителя с точно такими же антигенами*. Процесс часто сравнивают с раздачей фоторобота преступника сотрудникам полиции.
* — Хронологию разработки вакцин, информацию о влиянии вакцинации на характер эпидемий и численность человечества, доводы адептов движения антивакцинации и ответы на множество животрепещущих вопросов относительно целесообразности, пользы и вреда прививок можно найти в статье «Вакцины в вопросах и ответах» [1] . — Ред.
За 200 лет форма и содержание прививок претерпели существенные изменения: Дженнер инфицировал царапины содержимым оспинных пустул, Пастер облагородил процедуру, вводя ослабленных агентов шприцем, затем научились создавать вакцины из убитых и даже растерзанных возбудителей (сплит- и субъединичные вакцины), недавно начали использовать рекомбинантные вакцины , содержащие один или несколько антигенов (обычно белковых), синтезированных генно-инженерным путем. И вот в двери ВОЗ робко стучится новый плод, порожденный слиянием науки с фарминдустрией, — вакцина из нуклеиновых кислот [2] .
Начало ДНК-вакцинологии связывают с работами Д. Танга (1992 г.), в которых была показана способность плазмидной ДНК, экспрессирующей гормон роста человека, индуцировать выработку антител.
В классическом варианте такие вакцины состоят из плазмидных ДНК , содержащих гены возбудителей инфекционных заболеваний (целевые гены, или иммуногены). Продукты данных генов способны вызывать развитие защитных реакций организма, выступая в этом случае в роли антигенов. Доставку ДНК в макроорганизм первоначально осуществляли в комплексе с катионными липидами, однако эффект от введения препарата чистой нуклеиновой кислоты оказался более выраженным. Введенная в организм ДНК проникает в клеточное ядро, превращая клетку в завод по производству вакцины. Такая ДНК длительное время существует вне хромосом без репликации , транскрибируется за счет ферментов хозяйской клетки и экспрессирует соответствующие гены, продукты которых вызывают формирование иммунитета (рис. 1).
ДНК-вакцины сохраняются в организме 3–4 недели. За это время они успевают индуцировать Т- и В-клеточный иммунитет (рис. 2). Однако, несмотря на кажущуюся простоту, многие механизмы развития иммунного ответа на ДНК-вакцины остаются малоизученными [3] .
Более чем 20-летняя эволюция ДНК-вакцин продолжается и сегодня. Прогресс в дизайне кодирующих антигены нуклеотидных последовательностей, в оптимизации состава (в том числе включение молекулярных адъювантов ), в совершенствовании форм и физических методов доставки позволил второму поколению ДНК-вакцин преодолеть такие проблемы первого поколения, как низкий уровень трансфекции и недостаточная иммуногенность.
Сейчас разработки в области генетических вакцин проводятся во многих странах мира. В настоящее время сконструированы экспериментальные ДНК-вакцины для профилактики инфекционных заболеваний паразитарной (шистосомоз, лейшманиоз), бактериальной (хламидиоз, сибирская язва, микоплазмозы) и вирусной (бешенство, лихорадки Западного Нила и Эбола) природы. На разных стадиях доклинических и клинических испытаний находятся генетические вакцины против вирусов гриппа, гепатитов А и В, герпеса, кори, геморрагических лихорадок, ВИЧ, собачьей чумы, ящура, папилломавирусов, цитомегаловирусов. Столь интенсивное развитие данного направления вакцинологии, вероятно, уже в ближайшей перспективе обеспечит реальный выход в виде эффективных и безопасных вакцинных препаратов, рекомендованных для применения в здравоохранении и ветеринарии.
Для получения ДНК-вакцин ген, кодирующий продукцию иммуногенного белка, необходимо встроить в вектор, роль которого выполняют бактериальная плазмида или вирус [4] . Вектор не должен реплицироваться в клетках макроорганизма, поэтому может содержать только прокариотические сайты инициации репликации.
Для создания ДНК-вакцин используются хорошо изученные плазмиды грамотрицательных бактерий (в основном E. coli), в частности многокопийная pUC19 или pBR322 и их производные. Разработаны специальные векторы для ДНК-вакцин — pcDNA3 и pcDNA3.1 ( Invitrogen ), которые содержат цитомегаловирусный (ЦМВ) промотор и сигнал полиаденилирования гена гормона роста быка. Также к коммерчески доступным плазмидам, которые чаще всего используются в качестве векторов для ДНК-вакцин, относятся: pVAX1 (Invitrogen), pCI, VR1012 DNA, pJW4303, pVAC1-mcs и pVAC2-mcs ( InvivoGen ). Последние две применяются для усиления гуморального иммунного ответа и содержат антигены к поверхностным структурам мышечных клеток [5] .
Из числа вирусных векторов, обеспечивающих более высокий уровень экспрессии целевого антигена, чаще всего используются: дефектный по репликации аденовирус серотипа 5 (AD5), ортопоксвирусы и модифицированные вирусы осповакцины, альфавирусы. Аденовирусный вектор обладает высокой эффективностью трансфекции — до 100 %, в него можно включать до 8 т.п.н. ДНК. Отрицательный момент — синтез собственных белков, способных индуцировать иммунный ответ. Самые используемые осповакцинные модификации — Ankara (MVA) и New York Vaccinia strain (NYVAC). Первая получена в результате 56-кратного пассирования вируса в куриных эмбриональных фибробластах. В геноме NYVAC удалено 18 открытых рамок считывания, ассоциированных с диапазоном хозяев и вирулентностью. В каждый из перечисленных векторов можно встроить до 50 т.п.н. ДНК [6] .
Чтобы пригодиться для создания ДНК-вакцин, каждый уважающий себя вектор должен содержать необходимые конструкционные элементы (рис. 3).
Способам введения ДНК-вакцин в организм уделяется не меньше внимания, чем созданию самих конструкций, так как от этого зависит успех иммунизации в целом. Поэтому разработаны различные, порой весьма хитроумные, методы доставки таких вакцин в организм.
Самый простой — это парентеральный способ введения, который заключается в инъекции ДНК-вакцин в солевом растворе (внутримышечно, внутрикожно). При этом бόльшая часть ДНК поступает в межклеточное пространство и только потом включается в клетки.
Использование генного пистолета. Для этого ДНК фиксируют на микроскопических золотых гранулах (около 1–2 мкм), а затем с помощью устройства, приводимого в действие сжатым гелием, гранулы «выстреливают» непосредственно внутрь клеток (рис. 4). Для данного способа доставки требуется значительно меньшее количество вводимого материала, чем для внутримышечной инъекции. Так, для инъекции мышам нужно 10-100 мкг препарата, а с использованием генного пистолета достаточно 0,1-1 мкг.
Электропорация — техника, которая с использованием электрических импульсов позволяет формировать поры в клеточной мембране и доставлять ДНК непосредственно в клетки.
Микроконтейнеры из полиматериалов. Московские ученые, например, создали пористую микросферу из карбоната кальция, покрытую несколькими слоями полисахаридов, в которую упаковывается молекула ДНК. Если микросферы в полимерной оболочке поместить в подкисленный раствор, карбонат кальция внутри растворится и уйдет через полимерную мембрану. Внутри останется только ДНК, подлежащая транспортировке. Подобных микроконтейнеров для доставки ДНК разработано не так много. Есть зарубежные аналоги, в которых оболочка капсулы выполнена из полимолочной кислоты. На их основе создают вакцины против гепатита и даже СПИДа. Средний диаметр микрокапсул для доставки ДНК-вакцин всего 1–2 микрона. Такие микрокапсулы можно ввести подкожно или даже в кровь. Если в микрочастицу вместе с ДНК или лекарством поместить фермент, расщепляющий оболочку капсулы изнутри, то высвобождением лекарства можно управлять: чем меньше фермента, тем медленнее рушится оболочка.
Липосомные носители обеспечивают высокую эффективность доставки при внутривенном введении, при этом экспрессия целевых генов значительно возрастает, так как осуществляется во многих органах, и особенно в селезенке.
ДНК-вакцины можно вводить перорально с использованием бактериальных носителей. Для этих целей применяются, например, модифицированные бактерии Shigella flexneri с делецией в гене asd. Мутантные бактерии растут in vitro на среде с диаминопимелиновой кислотой и, проникая в эукариотические клетки, не размножаются в них, так как отсутствует упомянутая кислота, а продуцируют закодированные в плазмиде антигены [6] . Для перорального введения создан вектор на основе ослабленного штамма Salmonella, который способен к самоуничтожению в организме через определенный период времени после выполнения иммунизационных задач. Для этого бактерию модифицировали таким образом, что ее выживание стало зависеть от наличия искусственных сахаров, не встречающихся в условиях организма. После того как в клетках, зараженных генно-инженерным штаммом Salmonella, заканчивается запас специфического сахара, поставляемого вместе с вакциной, бактерии не способны сохранить целостность своих клеточных стенок, что приводит к их гибели [11] .
Была предложена оригинальная система доставки ДНК с помощью «теней» — неживых клеток грамотрицательных бактерий, лишенных цитоплазматического содержимого, но сохраняющих морфологию и антигенные структуры, включая адгезивные факторы. «Тени» обладают тропностью к антигенпрезентирующим клеткам макроорганизма и адъювантными свойствами, усиливающими иммунный ответ. Кроме того, в лиофильно-высушенном состоянии препараты «теней» хранятся при комнатной температуре неопределенно долгое время, а их производство дешево [6] .
Разработана технология доставки ДНК-вакцин с использованием бактериофагов [12] . В данном случае вакцинная ДНК встраивается в геном вектора-бактериофага, которым затем иммунизируют макроорганизм [13] .
Нужно учитывать, что разные методы доставки ДНК-вакцин в организм обеспечивают развитие различных клеточных реакций, при этом важные иммунологические пути могут быть стимулированы или, наоборот, не задействованы в ходе развития защитного ответа. Способы и места введения ДНК-вакцин варьируют для разных видов организмов. Например, уши свиньи — отличное место для инъекций, а вот введение препарата в уши овец или коров неэффективно.
Для усиления иммунного ответа, вызванного ДНК-вакцинами, совместно с ними вводят различные адъюванты, например, плазмиды, кодирующие синтез цитокинов , гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора и других костимуляторных молекул (B7.1 (CD80), B7.2 (CD86) и CD40) [14] .
Для ДНК-вакцины против ВИЧ создана конструкция, которая обеспечивает получение более высокого титра антител и его сохранность в течение более длительного времени по сравнению с обычной ДНК-вакциной. Эта молекулярная вирусоподобная конструкция представляет собой частицы диаметром 25-30 нм, содержащие в центре полинуклеотидный комплекс — рекомбинантную плазмиду pGEX-2T-TBI с генами инфекционного агента ВИЧ-1 или двухцепочечную РНК, которая является стимулятором неспецифической резистентности организма. На поверхности конструкции располагаются гибридные белки, содержащие эпитопы ВИЧ-1 и фермент (например, глутатион-S-трансферазу или галактозидазу). Связь между полинуклеотидным комплексом и гибридными белками осуществляется посредством конъюгата: спермидин (для связи конъюгата с полинуклеотидным комплексом) — полиглюкин — субстрат для фермента (например, глутатион или галактопиранозид; для аффинной сорбции гибридных белков на конструкцию).
В настоящее время в разработке находится около 420 ДНК-вакцин против заболеваний различной этиологии как человека, так и животных.
Бόльшая часть разрабатываемых противоинфекционных терапевтических ДНК-вакцин нацелена на ВИЧ-1. Существенные успехи достигнуты в активной иммунизации против вируса папилломы человека. Некоторые вакцины находятся на стадии клинических испытаний и, возможно, в скором времени будут введены в обязательную практику. Так, американская компания Inovio , специализирующаяся на разработке ДНК-вакцин, создала препарат против цервикальной дисплазии VGX-3100, который проходит вторую фазу клинических испытаний. В 2013 г. VGX-3100 удостоилась награды «Лучшая терапевтическая вакцина» на Всемирном конгрессе по вакцинам. В I или IIа фазах клинических испытаний находятся: вакцины против гепатита С, цервикального рака, рака головы и шеи, СПИДа, гриппа. Компанией Inovio также ведется активная разработка вакцин против лихорадки Эбола* и рака простаты.
* — О более привычном, но не менее перспективном методе борьбы с вирусом Эбола — с помощью «коктейля» из моноклональных антител — читайте в статье «Вирус Эбола и макак-резус: получено новое эффективное лекарство» [15] . — Ред.
Разработке способов вакцинотерапии онкологических заболеваний при помощи рекомбинантных ДНК большое внимание уделяют и другие организации. Хорошую эффективность показала ДНК-вакцина против лейкемии, созданная в Саутгемптонском университете (но вводимая с помощью электропоратора всё той же Inovio). Вакцина направлена на подавление в организме активности гена WT1 (Wilms tumor gene). Именно повышенная активность этого гена отмечается в опухолевых клетках различных видов. В ходе I фазы клинических испытаний у пациентов наблюдалось развитие иммунного ответа, в том числе активация Т-киллеров и выработка антител; была также доказана безопасность новой вакцины. Испытания перешли в фазу II, однако из-за проблем с финансированием организаторы пока не могут увеличить число участников [16] .
Животные нуждаются в такой же защите, как и люди. В связи с этим для ветеринарии разрабатываются ДНК-вакцины против бычьего и лошадиного герпесвирусов, собачьего вируса чумы, вируса классической свиной лихорадки, кроличьей папилломы, ящура, вируса инфекционного гемопоэтического некроза, вируса гриппа, вируса японского энцефалита, вируса бешенства, вируса везикулярного стоматита и т.д. [13] . Много ДНК-вакцин создается для борьбы с вирусными, бактериальными и эукариотическими патогенами рыб [17] .
Активно разрабатываются ДНК-вакцины для повышения иммунитета птиц. Многокомпонентные ДНК-вакцины могут сократить количество прививок, необходимых во время короткой жизни птиц и позволят избежать риска увеличения вирулентности некоторых патогенов. В случае птицеводства проблема связана с тем, что вакцины вводятся в амниотическую жидкость яиц, которая обладает ДНКазной активностью, поэтому свойства ДНК-вакцины могут ухудшиться. Заключение ДНК в катионные липосомы, скорее всего, поможет решить эту проблему.
Из множества разработанных ДНК-вакцин на сегодняшний день лицензировано всего несколько, причем повезло в этом плане только животным (табл. 1).
Торговое название вакцины |
Год лицензирования |
Мишень |
Животное |
Продукт вакцины |
Цель создания вакцины |
---|---|---|---|---|---|
«Вэст Найл-Инноватор» (США) |
2005 |
Вирус лихорадки Западного Нила |
Лошади |
Структурный белок вируса PreM-E |
Защита против вируса |
«Апекс-ай-эйч-эн» (Канада) Apex-IHN |
2005 |
Возбудитель инфекционного некроза гемопоэтической ткани (ИНГТ) |
Рыбы семейства лососевые |
Вирусный гликопротеин |
Повышение количества и качества рыбной продукции |
«ЛайфТайд Эс-Даблъю 5» (Австралия) LifeTide® SW 5 |
2008 |
Свиньи и другой домашний скот |
Соматолиберин свиньи |
Увеличение выводка у свиноматок; значительно уменьшает перинатальную смертность и заболеваемость |
|
«Онцепт» (США) |
2006 |
Собаки |
Тирозиназа человека |
Как альтернатива лучевой терапии и операционному вмешательству при лечении меланомы |
|
(Бразилия) |
2001 |
Пневмония |
Исследована на мышах |
Поверхностный адгезин А пневмококка |
Борьба со Streptococcus pneumoniae |
West Nile Virus DNA Vaccine (США) USDA: 1995.D0 |
Вирус лихорадки Западного Нила |
Сейвал (сайдяной, или ивасёвый кит) |
Структурный белок вируса |
Защита от вируса |
Данные вакцины, одобренные Управлением по контролю над продуктами питания и лекарственными препаратами США ( FDA ), созданы на основе плазмид. Для первых трех из них рекомендованный производителем способ введения — внутримышечно, для вакцины «ЛайфТайд» — внутримышечная инъекция, совмещенная с электропорацией. Если остальные вакцины направлены на активацию иммунитета, то для препарата «ЛайфТайд» иммуностимулирующее действие является дополнительным. Продукт вакцины — соматолиберин — стимулирует высвобождение гипофизом гормона роста и пролактина. Их действие у свиней приводит к росту массы животных и увеличению численности выводка. Вместе с тем, введение плазмиды, которая кодирует соматолиберин, стимулирует выработку Т-лимфоцитов и естественных киллеров , следовательно, увеличивает иммунную сопротивляемость организма.
Процедура внедрения препаратов в ветеринарную практику проще, чем в клиническую человеческую, поэтому некоторые ДНК-вакцины уже применяются для иммунизации животных.
Рутинно используются вакцины для оральной иммунизации лисиц против бешенства. Рекомбинантные вакцины V-RG (Vaccinia Rabies Glyсoprotein — оспенный гликопротеин вируса бешенства) созданы путем введения в геном вируса оспы последовательности ДНК, кодирующей гликопротеин вируса бешенства. Вакцинация лисиц была начата в 2007 году, а к 2009 г. заболеваемость сократилась на 85% [19] .
Созданы противоопухолевые препараты, которые продемонстрировали высокую эффективность на животных и применяются в ветеринарной практике. Для лечения меланомы у собак в ветеринарии США с 2007 года используется ДНК-вакцина «Онцепт» (рис. 5). Как показала практика, этот препарат излечивает от меланомы или существенно продлевает больным собакам жизнь [20] .
Более новый препарат « Еленаген » (Elenagen) был разработан международным консорциумом под руководством компании CureLab Oncology (США). Хотя «Еленаген» является новым препаратом, с ним уже были проведены обширные исследования на различных опухолях мышей и крыс. Эти исследования с использованием сотен животных показали, что препарат подавляет рост саркомы, рака молочной железы, карциномы легких и меланомы, т.е. быстрорастущих и очень агрессивных опухолей. «Еленаген» не продемонстрировал токсического побочного действия. Более того, препарат оказался эффективным и в случае лимфосаркомы собак. В настоящее время начато исследование спектра противоопухолевого действия «Еленагена» у собак и кошек. В отличие от «Онцепта», который эффективен только при меланоме, вакцина «Еленаген» подавляет рост как меланомы, так и других злокачественных опухолей. За счет более разнопланового механизма действия новый препарат может оказывать дополнительное оздоровляющее и укрепляющее влияние на организм животного.
* * *
Таким образом, с помощью ДНК-вакцин можно сформировать устойчивый иммунитет против инфекционных агентов различной природы. Их разработкой уже более 20 лет занимаются в различных лабораториях мира, но, несмотря на это, такие вакцины практически не используются в клинической практике. Это связано с тем, что пока нет ответов на ряд вопросов, касающихся в первую очередь безопасности ДНК-вакцин. Хотя имеющиеся данные не дают оснований для особенного волнения: эти препараты не опаснее многих факторов, воздействию которых человек сознательно подвергает себя ежедневно. ДНК-вакцины вполне могут оказаться чудесным открытием, которое спасет многие жизни.